基于CTC的液体活检具有高特异性的特点，可全面挖掘肿瘤预后信息、耐药机制、转移发生等关键信息，有利于患者的精准治疗。在检测流程中，全血标本的即时处理和稳定保存是确保准确的分子组学数据来指导临床决策的前提。但是，由于循环肿瘤细胞的脆弱性和稀有性，血液标本的长周期稳定化处理仍面临着巨大的挑战。

 

 

近日，来自天津大学的杨静和张雷团队建立了一个两性离子微凝胶平台，可用于全血标本的稳定化处理。在研究全血标本CTC损伤机制的基础上，研究者建立的这种微凝胶平台可防止这些机制对CTCs的损伤，从而实现全血标本的稳定保存和稀有CTCs的快速回收。另外，通过20例癌症患者的血液标本验证了该平台可显著延长CTC的存活率，血样保存时长达7天，是目前一般保存时间的两倍。该研究成果以题为“Zwitterionic microgel preservation platform for circulating tumor cells in whole blood specimen”发表在《Nature Communications》上。

研究者分析了CTC低温损伤的主要机制：(1)低温保存（HP)过程，副产物超氧阴离子诱导红细胞发生连锁氧化反应，主要诱导全血样本微环境中过氧化氢(H₂O₂)和羟基自由基(•OH)等活性氧（ROS）的过量产生，对于血液中罕见的CTC，红细胞产生的ROS诱导膜脂和蛋白的过氧化，导致细胞凋亡。(2)除了来自其他细胞的ROS过量产生外，低温诱导的血小板活化也是HP期间CTC丢失的主要原因。(3) CTCs从体内肿瘤组织中逃逸，其中细胞外基质(ECM)为细胞提供化学相互作用和物理支持。一旦从ECM中分离出来，CTC的细胞骨架分解会诱导caspase蛋白酶的激活，导致程序性细胞死亡。在了解该机制的基础上，研究者设计了一种两性离子-苯硼酸（ZBA）和两性离子-聚乙烯醇（ZVA）微凝胶组件，它能形成一种自愈合 ZBVA 水凝胶，这种微凝胶可以保护CTCs免受上述三种损伤，包括清除ROS、抑制血小板活化和模拟ECM(图1)。

图1. 用于保存全血标本中 CTCs 的两性离子微凝胶平台

这种新型的自愈合磁性ZBVA 水凝胶是由两性离子苯基溴酸(ZBA)和两性离子聚乙烯醇(ZVA)微凝胶组装而成的。具有以下的特点和优势：(1)具有可逆性，由苯硼酸基团和二醇基团之间形成的硼酯键是可逆的，可以在不同的溶液中快速组装或解离。(2)具有良好的弹性和自愈合能力，可以在环境温度下自动修复断裂或切割。(3)具有磁性，可以通过磁场进行快速和方便的分离和富集。(4)具有抗生物污染和细胞相容性，可以用来包裹和保存活体细胞，而不会引起细胞的吸附或毒性反应。该保存平台主要通过三个系统避免CTC低温损伤：第一，包埋细胞的ZBVA水凝胶系统可清除活性氧和模拟ECM；第二，包埋细胞的PCB微凝胶3D保存系统实现ECM模拟支撑；第三，ZBVA-N水凝胶系统使ZBVA水凝胶与细胞通过Transwell隔离起到清除ROS的作用。

图2. ZBVA水凝胶的形成与特性

为了评价ZBVA水凝胶的保存效果，研究者对20例乳腺癌患者的血液标本进行了队列研究，并与CPDA（一种常用的血液防腐剂）进行了对比。由于CTCs在全血样本中的稀缺性，作者采用了一种模型系统，即在患者血液中加入已知数量和类型的癌细胞，作为模拟CTCs，来准确评估保存平台的性能。将模型CTCs加入的患者血液分别用ZBVA水凝胶和CPDA保存7天，然后用磁分离法分离出CTCs，并用CTC富集试剂盒进行进一步处理。通过荧光共聚焦显微镜、血液分析仪和流式细胞仪等方法，作者检测了CTCs的数量及活性。研究结果发现ZBVA水凝胶能够有效地保护CTCs免受低温损伤，使其在7天内保持高活性而CPDA保存的CTCs则表现出明显的活性下降。

图3. ZBVA水凝胶保存的模拟CTCs活性验证

该研究设计了一种基于两性离子微凝胶的保存平台，以此来抵抗血液标本中CTCs遭受的三种主要损伤，即活性氧（ROS）过量产生、细胞外基质（ECM）丢失和血小板激活。由于这种微凝胶平台的独特设计，微凝胶组装之间的硼化键和由非粘附聚合物网络提供了三维支撑环境。同时，微粒中的磁性纳米颗粒（MNPs）可以使保存的细胞更容易回收。此外，研究者通过对20例癌症患者的血液标本进行研究，验证了这种平台可以显著延长标本中模型CTCs的寿命时间的特性，是目前可行保存时间的两倍。这项工作阐明了血液标本中稀有CTC细胞遭受的主要损伤，而这种保存技术也为基于血液的无创诊断系统的发展开拓了思路。

参考文献：

Ma Y, Zhang J, Tian Y. et al. Zwitterionic microgel preservation platform for circulating tumor cells in whole blood specimen. Nat Commun. 2023 Aug 16;14(1):4958.

 

 

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